Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion (engl.: Polymerase Chain Reaction, PCR) ist eine Methode, um die DNA in vitro zu vervielfältigen. Dazu wird ein Enzym verwendet, die DNA-Polymerase. Der Begriff „Kettenreaktion” beschreibt in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass die Produkte vorheriger Zyklen als Ausgangsstoffe für den nächsten Zyklus dienen und somit eine exponentielle Vervielfältigung ermöglichen.

Die PCR ist eine der wichtigsten Basisethoden der Molekularpathologie. Die PCR wird eingesetzt, um einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder aber um nicht-kodierende DNA-Sequenzen handeln. Bei einer Standard-PCR können dies bis zu etwa 3.000 Basenpaare (3kb) lange DNA-Abschnitte sein. Mit Hilfe spezieller PCR-Methoden können heute auch Fragmente mit einer Länge von über 20–40kb vervielfältigt werden, was immer noch sehr viel kürzer ist als die chromosomale DNA einer eukaryotischen Zelle.

Für die Standard-PCR werden folgende Ausgangsstoffe benötig:

  • die Original-DNA, die den zu vervielfältigenden Abschnitt enthält (Template), z.B. isoliert aus dem zu untersuchenden Tumorgewebe,
  • zwei Primer, um auf den beiden Einzelsträngen der DNA jeweils den Startpunkt der DNA-Synthese festzulegen, wodurch der zu vervielfältigende Bereich von beiden Seiten begrenzt wird,
  • DNA-Polymerase, die bei hohen Temperaturen nicht zerstört wird, um den festgelegten Abschnitt zu replizieren (z. B. Taq-Polymerase)
  • Desoxyribonucleosidtriphosphate, die Bausteine für den von der DNA-Polymerase synthetisierten DNA-Strang
  • Mg2+-Ionen, für die Funktion der Polymerase essentiell sind,
  • Pufferlösungen, die eine für die DNA-Polymerase geeignete chemische Umgebung sicherstellen.

Die PCR wird in einem sogenannten Thermocycler durchgeführt. Der Thermocycler erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionspartner präzise auf die Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird.

Der PCR-Prozess durchläuft eine Anzahl von etwa 20-50 Zyklen, die in einem Thermocycler durchgeführt werden. Jeder klassische PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten:

  1. Denaturierung (melting, Schmelzen): die doppelsträngige DNA wird auf 94–96 °C erhitzt, um die Stränge zu trennen. Die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden DNA-Strängen werden aufgebrochen. Im ersten Zyklus wird die DNA oft für längere Zeit erhitzt (Initialisierung), um sicherzustellen, dass sich sowohl die Ausgangs-DNA als auch die Primer vollständig voneinander getrennt haben und nur noch Einzelstränge vorliegen.
  2. Primerhybridisierung (annealing): Die Temperatur wird ca. 30 Sekunden lang auf einem Wert gehalten, der eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Die genaue Temperatur wird durch die Länge und die Sequenz der Primer bestimmt.
  3. Elongation (Extending, Polymerisation, Verlängerung, Amplifikation): Die DNA-Polymerase verlängert die DNA beginnend am Primer mit freien Nukleotiden, komplementär zum DNA-Template (Muttermolekül). Sie beginnt am 3'-Ende des angelagerten Primers und folgt dann dem DNA-Strang. Die Temperatur hängt vom Arbeitsoptimum der verwendeten DNA-Polymerase ab (68–72 °C). Dieser Schritt dauert etwa 30 Sekunden je 500 Basenpaare, variiert aber in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-Polymerase.

Je nach Anwendungsgebiet kommen verschiedene PCR-Techniken zur Anwendung:

  • real-time PCR bzw. quantitative PCR (qPCR)
  • Reverse Transkription und PCR (RT-PCR)
  • Multiplex-PCR
  • immunoquantitative real time-PCR (irt-PCR)
  • Nested-PCR
  • Touchdown-PCR