Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül. Die DNA-Sequenzierung hat die biologischen Wissenschaften revolutioniert und die Ära der Genomik eingeleitet. Zusammen mit anderen DNA-analytischen Verfahren wird die DNA-Sequenzierung z.B. zur Erkennung genetisch bedingter Erkrankungen herangezogen.

Die Didesoxymethode nach Sanger wird auch Kettenabbruch-Synthese genannt. Sie stellt eine enzymatische Methode dar, die von Sanger und Coulson um 1975 entwickelt wurde.

Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz (Primer) wird durch eine DNA-Polymerase einer der beiden komplementären DNA-Stränge verlängert. Dazu wird die DNA-Doppelhelix durch Erwärmung denaturiert, woraufhin Einzelstränge für das weitere Vorgehen zur Verfügung stehen. In einem Ansatz werden die vier mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markierten Nukleotide als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugegeben. Diese Kettenabbruch-ddNTPs besitzen keine 3'-Hydroxygruppe: Werden sie in den neusynthetisierten Strang eingebaut, ist eine Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase nicht mehr möglich, da die OH-Gruppe am 3'-C-Atom für die Verknüpfung mit der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids fehlt. In der Folge entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die entstehenden Kettenabbruchprodukte werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Die ddNTPs am Ende jedes DNA-Fragmentes zeigen dadurch Fluoreszenz unterschiedlicher Farbe und können so von einem Detektor erkannt werden. Das Chromatogramm (die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen) gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder.